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ADPG焦磷酸化酶(AGP)测试盒
点击次数:152 发布时间:2020/8/28 18:44:30
详细内容
产品名称:ADPG焦磷酸化酶(AGP)测试盒
规格:50管/48样 :100管/96样
产品内容:
试剂一:液体×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加5 mL蒸馏水溶解。
自备仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。
操作步骤:
一、粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接测定。
二、测定操作:
1. 分光光度计预热30 min,调节波长到340 nm,用蒸馏水调零。
2. 试剂三放在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)保温。
3. 空白管:取1mL石英比色皿,加入100μL试剂一,900μL试剂二和100μL试剂三,迅速混匀后于340nm测定吸光度变化,记录10 s和310 s吸光度为A1和A2。
4. 测定管:取1mL石英比色皿,加入100μL上清液,900μL试剂二和100μL试剂三,迅速混匀后于340nm测定吸光度变化,记录10 s和310 s吸光度为A3和A4。 注意:空白管只需测定一次。
三、GST活性计算公式:
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位定义:在25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。
GST(nmol/min/mg prot)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×109×V反总÷(Cpr×V样)÷T
=230×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义:在25℃或者37℃中,每克样品每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。
GST(nmol/min/g)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×109×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T =230×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W
(3) 按细胞数量计算
活性单位定义:在25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。
GST(nmol/min/104 cell)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×109×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T =230×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:在25℃或者37℃中,每毫升液体每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。
GST(nmol/min/mL)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷ε÷d×109×V反总÷V样÷T
= 230×[(A4-A3)-(A2-A1)]
ε:产物摩尔消光系数,9.6×103 L/mol /cm;d:比色皿光径,1cm;106:1mol=1× 106μmol;V反总:反应体系总体积,1100μL=0.0011 L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议选用本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒;V样:加入反应体系中上清液体积,100μL=0.1 mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W,样本质量,g;T:反应时间(min),5min。
ADPG焦磷酸化酶(AGP)测试盒注意事项:
1. 样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;
2. 细胞中GST活性测定时,细胞数目须在300万-500万之间,细胞中GST的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞;
3. 本法测定GST活性的线性范围可达76 μmol/min /L,测定前先用1~2个样做预实验,如5min内反应不成线性,须对样品用蒸馏水稀释,计算结果乘以稀释倍数;
4. 测定反映的温度对测定结果有影响,请控制在25℃或者37℃(哺乳动物)。
更新时间:2023/11/11 17:28:18
标签:ADPG焦磷酸化酶(AGP)测试盒
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